Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние ще визуализираме сайта без стилове и JavaScript.
Термофилите са микроорганизми, които виреят при високи температури. Изучаването им може да предостави ценна информация за това как животът се адаптира към екстремни условия. Въпреки това е трудно да се постигнат условия на висока температура с конвенционалните оптични микроскопи. Предложени са няколко домашни решения, базирани на локално резистивно електрическо отопление, но няма просто търговско решение. В тази статия ние въвеждаме концепцията за микромащабно лазерно нагряване над зрителното поле на микроскопа, за да осигурим високи температури за термофилни изследвания, като същевременно поддържаме околната среда на потребителя мека. Нагряването в микромащаб при умерен лазерен интензитет може да се постигне с помощта на субстрат, покрит със златни наночастици, като биосъвместим и ефективен абсорбатор на светлина. Обсъждат се възможните ефекти от микромащабната конвекция на течности, задържането на клетките и центробежното термофоретично движение. Методът е демонстриран при два вида: (i) Geobacillus stearothermophilus, активна термофилна бактерия, която се възпроизвежда при около 65°C, която наблюдавахме да покълва, расте и плува при нагряване в микромащаб; (ii) Thiobacillus sp., оптимално хипертермофилна архея. при 80°C. Тази работа проправя пътя за просто и безопасно наблюдение на термофилни микроорганизми с помощта на модерни и достъпни инструменти за микроскопия.
В продължение на милиарди години животът на Земята се е развил, за да се адаптира към широк спектър от условия на околната среда, които понякога се смятат за екстремни от нашата човешка гледна точка. По-специално, някои термофилни микроорганизми (бактерии, археи, гъби), наречени термофили, виреят в температурния диапазон от 45°C до 122°C1, 2, 3, 4. Термофилите живеят в различни екосистеми, като дълбоководни хидротермални извори, горещи извори или вулканични зони. Техните изследвания предизвикаха голям интерес през последните няколко десетилетия поради поне две причини. Първо, можем да научим от тях, например, как термофилите 5, 6, ензимите 7, 8 и мембраните 9 са стабилни при толкова високи температури или как термофилите могат да издържат на екстремни нива на радиация10. Второ, те са основата за много важни биотехнологични приложения1,11,12 като производство на гориво13,14,15,16, химичен синтез (дихидро, алкохоли, метан, аминокиселини и др.)17, биодобив18 и термостабилни биокатализатори7,11, 13. По-специално, понастоящем добре известната полимеразна верижна реакция (PCR)19 включва ензим (Taq полимераза), изолиран от термофилната бактерия Thermus aquaticus, една от първите открити термофили.
Изследването на термофилите обаче не е лесна задача и не може да се импровизира в никоя биологична лаборатория. По-специално, живите термофили не могат да бъдат наблюдавани in vitro с който и да е стандартен светлинен микроскоп, дори с налични в търговската мрежа нагревателни камери, обикновено предназначени за температури до 40°C. От 90-те години на миналия век само няколко изследователски групи са се посветили на въвеждането на системи за високотемпературна микроскопия (HTM). През 1994 г. Glukh et al. Камерата за нагряване/охлаждане е замислена въз основа на използването на клетка на Пелтие, която контролира температурата на затворени правоъгълни капиляри, за да се поддържа анаеробност 20 . Устройството може да се нагрява до 100 °C със скорост 2 °C/s, което позволява на авторите да изследват подвижността на хипертермофилната бактерия Thermotoga maritima21. През 1999 г. Horn et al. Разработено е много подобно устройство, което все още се основава на използването на нагрети капиляри, подходящи за търговска микроскопия за изследване на клетъчното делене/свързване. След дълъг период на относително бездействие, търсенето на ефективни HTM се възобнови през 2012 г., по-специално във връзка със серия от статии на групата Wirth, които използват устройство, изобретено от Horn et al. Преди петнадесет години подвижността на голям брой археи, включително хипертермофили, беше изследвана при температури до 100°C с помощта на нагрети капиляри 23, 24. Те също модифицираха оригиналния микроскоп, за да постигнат по-бързо нагряване (няколко минути вместо 35 минути за достигане на зададената температура) и да постигнат линеен температурен градиент от повече от 2 cm в средата. Това устройство за оформяне на температурен градиент (TGFD) е използвано за изследване на мобилността на много термофили в рамките на температурни градиенти на биологично значими разстояния 24, 25.
Нагряването на затворени капиляри не е единственият начин за наблюдение на живи термофили. През 2012 г. Kuwabara et al. Използвани са домашни камери Pyrex за еднократна употреба, запечатани с топлоустойчиво лепило (Super X2; Cemedine, Япония). Пробите бяха поставени върху налична в търговската мрежа прозрачна нагревателна плоча (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Япония), способна да се нагрява до 110 ° C, но първоначално не е предназначена за биоизображение. Авторите наблюдават ефективно разделяне на анаеробни термофилни бактерии (Thermosipho globiformans, време на удвояване 24 минути) при 65°C. През 2020 г. Pulshen et al. Ефективното нагряване на търговски метални съдове (AttofluorTM, Thermofisher) беше демонстрирано с помощта на два домашни нагревателни елемента: капак и платформа (конфигурация, вдъхновена от PCR машина). Тази връзка води до еднаква температура на течността и предотвратява изпарението и кондензацията в долната част на капака. Използването на О-пръстен избягва обмена на газ с околната среда. Този HTM, наречен Sulfoscope, беше използван за изобразяване на Sulfolobus acidocaldarius при 75°C27.
Признато ограничение на всички тези системи беше ограничението за използване на въздушни обективи, като всяко маслено потапяне е неподходящо за такава висока температура и за изобразяване през прозрачни проби с дебелина >1 mm. Признато ограничение на всички тези системи беше ограничението за използване на въздушни обективи, като всяко маслено потапяне е неподходящо за такава висока температура и за изобразяване през прозрачни проби с дебелина >1 mm. Общоизвестният недостатък на всички тези системи беше ограничен при използване на въздушни обективи, тъй като всяко потапяне в маслото не беше подходящо за такава висока температура и за визуализация чрез прозрачни образци с дебелина > 1 mm. Признат недостатък на всички тези системи беше ограничението за използване на въздушни обективи, тъй като всяко маслено потапяне не беше подходящо за такава висока температура и за визуализация чрез прозрачни проби с дебелина > 1 mm.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1毫米厚的透明样品成像。 Признато ограничение на всички тези системи е ограничението за използване на огледало с въздушно увличане, тъй като всяко маслено потапяне е неподходящо за изобразяване на прозрачни проби с дебелина >1 mm при такива високи температури. Общоизвестният недостатък на всички тези системи е ограничено използване на въздушни обективи, всяко потапяне в масло, непригодно за такива високи температури и визуализации чрез прозрачни образци с дебелина >1 mm. Признат недостатък на всички тези системи е ограниченото използване на въздушни лещи, всяко маслено потапяне е неподходящо за такива високи температури и визуализация чрез прозрачни проби с дебелина >1 mm.Съвсем наскоро това ограничение беше премахнато от Charles-Orzag et al. 28, който разработи устройство, което вече не осигурява топлина около интересуващата ни система, а по-скоро вътре в самото покривно стъкло, покрито с тънък прозрачен слой от резистор, направен от ITO (индий-калаен оксид). Капакът може да се нагрее до 75 °C чрез преминаване на електрически ток през прозрачния слой. Авторът обаче трябва и да нагрее обектива до обектива, но не повече от 65 °C, за да не го повреди.
Тези работи показват, че разработването на ефективна високотемпературна оптична микроскопия не е широко възприето, често изисква домашно оборудване и често се постига с цената на пространствена разделителна способност, което е сериозен недостатък, като се има предвид, че термофилните микроорганизми не са по-големи от няколко микрометри. Намаленият обем на нагряване е ключът към решаването на три присъщи проблема на HTM: лоша пространствена разделителна способност, висока термична инерция, когато системата се нагрява, и вредно нагряване на околните елементи (потапящо масло, леща на обектив... или ръце на потребителя) при екстремни температури. ).
В тази статия ние въвеждаме HTM за термофилно наблюдение, което не се основава на резистивно нагряване. Вместо това постигнахме локализирано нагряване в рамките на ограничен участък от зрителното поле на микроскопа чрез лазерно облъчване на субстрат, абсорбиращ светлина. Разпределението на температурата се визуализира с помощта на количествена фазова микроскопия (QPM). Ефективността на този метод се демонстрира от Geobacillus stearothermophilus, подвижна термофилна бактерия, която се възпроизвежда при около 65°C и има кратко време на удвояване (около 20 минути), и Sulfolobus shibatae, хипертермофил, който расте оптимално при 80°C (археи) да илюстрирам. Нормална скорост на репликация и плуване се наблюдават като функция на температурата. Този лазер HTM (LA-HTM) не е ограничен от дебелината на покривното стъкло или от естеството на обектива (потапяне във въздух или масло). Това позволява да се използва всеки обектив с висока разделителна способност на пазара. Той също така не страда от бавно нагряване поради термична инерция (постига мигновено нагряване в скала от милисекунди) и използва само налични в търговската мрежа компоненти. Единствените нови опасения за безопасността са свързани с наличието на мощни лазерни лъчи (обикновено до 100 mW) вътре в устройството и вероятно през очите, което изисква защитни очила.
Принципът на LA-HTM е да се използва лазер за нагряване на пробата локално в зрителното поле на микроскопа (фиг. 1а). За да направите това, пробата трябва да абсорбира светлина. За да използваме разумна лазерна мощност (по-малко от 100 mW), ние не разчитахме на абсорбцията на светлина от течната среда, но изкуствено увеличихме абсорбцията на пробата чрез покриване на субстрата със златни наночастици (фиг. 1c). Нагряването на златни наночастици със светлина е от основно значение за областта на термичната плазмоника, с очаквани приложения в биомедицината, нанохимията или събирането на слънчева светлина 29, 30, 31. През последните няколко години използвахме този LA-HTM в няколко проучвания, свързани с приложения на топлинна плазма във физиката, химията и биологията. Основната трудност при този метод е в показването на крайния температурен профил, тъй като повишената температура е ограничена до област на микромащаб в пробата. Ние показахме, че картографирането на температурата може да бъде постигнато с интерферометъра за напречно срязване с четири дължини на вълната, прост метод с висока разделителна способност и много чувствителен метод за количествена фазова микроскопия, базиран на използването на двуизмерни дифракционни решетки (известни също като кръстосани решетки) 33,34,35,36. Надеждността на тази техника на термична микроскопия, базирана на микроскопия на вълнов фронт с кръстосана решетка (CGM), е демонстрирана в дузина статии, публикувани през последното десетилетие37,38,39,40,41,42,43.
Схема на монтаж на паралелен лазерен нагревателен, оформящ и температурен микроскоп. b Геометрия на пробата, състояща се от камера AttofluorTM, съдържаща покривно стъкло, покрито със златни наночастици. c Погледнете внимателно образеца (не в мащаб). d представлява равномерния профил на лазерния лъч и (e) симулираното последващо разпределение на температурата върху равнината на пробата на златните наночастици. f е пръстеновиден профил на лазерен лъч, подходящ за генериране на равномерна температура, както е показано в симулацията на полученото температурно разпределение, показано в (g). Скала: 30 µm.
По-специално, наскоро постигнахме нагряване на клетки от бозайници с LA-HTM и CGM и проследихме клетъчните реакции на топлинен шок в диапазона от 37-42°C, демонстрирайки приложимостта на тази техника за изобразяване на единични живи клетки. Въпреки това, приложението на LA-HTM за изследване на микроорганизми при високи температури не е недвусмислено, тъй като изисква повече внимание в сравнение с клетките на бозайници: първо, нагряването на дъното на средата с десетки градуса (а не с няколко градуса) води до до силен вертикален температурен градиент. може да създаде флуидна конвекция 44, която, ако не е здраво закрепена към субстрата, може да причини нежелано движение и смесване на бактерии. Тази конвекция може да се елиминира чрез намаляване на дебелината на течния слой. За тази цел, във всички експерименти, представени по-долу, бактериални суспензии бяха поставени между две покривни стъкла с дебелина приблизително 15 µm, поставени вътре в метална чаша (AttofluorTM, Thermofisher, Фиг. 1b,c). По принцип конвекцията може да се избегне, ако дебелината на течността е по-малка от размера на лъча на нагревателния лазер. Второ, работата в такава ограничена геометрия може да задуши аеробните организми (виж Фиг. S2). Този проблем може да бъде избегнат чрез използване на субстрат, който е пропусклив за кислород (или всеки друг жизненоважен газ), като се оставят уловени въздушни мехурчета вътре в покривното стъкло или чрез пробиване на дупки в горното покривно стъкло (виж Фиг. S1) 45 . В това проучване избрахме последното решение (фигури 1b и S1). И накрая, лазерното нагряване не осигурява равномерно разпределение на температурата. Дори при еднакъв интензитет на лазерния лъч (фиг. 1d), разпределението на температурата не е равномерно, а по-скоро наподобява разпределението на Гаус поради термична дифузия (фиг. 1e). Когато целта е да се установят точни температури в зрителното поле за изучаване на биологични системи, неравномерните профили не са идеални и могат също да доведат до термофоретично движение на бактерии, ако те не се придържат към субстрата (вижте Фиг. S3, S4)39. За тази цел използвахме модулатор на пространствена светлина (SLM), за да оформим инфрачервения лазерен лъч според формата на пръстена (фиг. 1f) в равнината на пробата, за да постигнем идеално равномерно разпределение на температурата в дадена геометрична област, въпреки термичната дифузия (Фигура 1d) 39, 42, 46. Поставете горно покривно стъкло върху метална чиния (Фигура 1b), за да избегнете изпаряването на средата и наблюдавайте поне няколко дни. Тъй като това горно покривно стъкло не е запечатано, може лесно да се добави допълнителна среда по всяко време, ако е необходимо.
За да илюстрираме как работи LA-HTM и да демонстрираме неговата приложимост в термофилни изследвания, ние изследвахме аеробните бактерии Geobacillus stearothermophilus, които имат оптимална температура на растеж около 60-65°C. Бактерията също има камшичета и способността да плува, което е друг индикатор за нормална клетъчна активност.
Пробите (фиг. 1b) бяха предварително инкубирани при 60°C за един час и след това поставени в LA-HTM държач за проби. Тази предварителна инкубация не е задължителна, но все пак полезна по две причини: Първо, когато лазерът е включен, той кара клетките незабавно да растат и да се делят (вижте филм M1 в Допълнителни материали). Без предварителна инкубация бактериалният растеж обикновено се забавя с около 40 минути всеки път, когато върху пробата се загрее нова зона за наблюдение. Второ, 1-часовата предварителна инкубация насърчава адхезията на бактериите към покривното стъкло, предотвратявайки излизането на клетките от зрителното поле поради термофореза, когато лазерът е включен (вижте филм M2 в Допълнителни материали). Термофорезата е движението на частици или молекули по температурен градиент, обикновено от горещо към студено, и бактериите не са изключение43,47. Този нежелан ефект се елиминира върху дадена област чрез използване на SLM за оформяне на лазерния лъч и постигане на равномерно разпределение на температурата.
На фиг. Фигура 2 показва температурното разпределение, измерено чрез CGM, получено чрез облъчване на стъклен субстрат, покрит със златни наночастици, с пръстеновиден лазерен лъч (фиг. 1f). Наблюдава се равномерно разпределение на температурата върху цялата площ, покрита от лазерния лъч. Тази зона беше настроена на 65°C, оптималната температура за растеж. Извън тази област температурната крива естествено пада до \(1/r\) (където \(r\) е радиалната координата).
Температурна карта на CGM измервания, получена чрез използване на пръстеновиден лазерен лъч за облъчване на слой от златни наночастици, за да се получи плосък температурен профил върху кръгла област. b Изотерма на температурната карта (a). Контурът на лазерния лъч е представен от сив пунктиран кръг. Експериментът се повтаря два пъти (вижте Допълнителни материали, Фигура S4).
Жизнеспособността на бактериалните клетки се наблюдава в продължение на няколко часа с помощта на LA-HTM. На фиг. 3 показва интервала от време за четири изображения, направени от 3 часа и 20 минути филм (Филм M3, Допълнителна информация). Наблюдавано е, че бактериите активно се размножават в рамките на кръговата област, определена от лазера, където температурата е оптимална, приближаваща се до 65°C. Обратно, клетъчният растеж беше значително намален, когато температурата падна под 50 ° C за 10 s.
Изображения с оптична дълбочина на бактерии G. stearothermophilus, растящи след лазерно нагряване в различно време, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, извън 200 Извлечено от едноминутен филм (филм M3, предоставен в допълнителна информация), насложен върху съответната температурна карта. Лазерът се включва в момент \(t=0\). Изотермите са добавени към изображението на интензитета.
За по-нататъшно количествено определяне на клетъчния растеж и неговата зависимост от температурата, ние измерихме увеличението на биомасата на различни колонии от първоначално изолирани бактерии в зрителното поле на Movie M3 (фиг. 4). Родителските бактерии, избрани в началото на образуването на мини колония, образуваща единица (mCFU), са показани на фигура S6. Измерванията на суха маса бяха направени с камера CGM 48, която беше използвана за картографиране на температурното разпределение. Способността на CGM да измерва сухо тегло и температура е силата на LA-HTM. Както се очакваше, високата температура предизвика по-бърз бактериален растеж (фиг. 4а). Както е показано в полулогаритмичната диаграма на Фиг. 4b, растежът при всички температури следва експоненциален растеж, където данните използват експоненциалната функция \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), където \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – време на генериране (или време на удвояване), \( g =1/ \tau\) – темп на растеж (брой деления за единица време). На фиг. 4с показва съответната скорост на растеж и време на генериране като функция на температурата. Бързо растящите mCFU се характеризират с насищане на растежа след два часа, очаквано поведение поради високата бактериална плътност (подобно на стационарната фаза в класическите течни култури). Общата форма \(g\left(T\right)\) (фиг. 4c) съответства на очакваната двуфазова крива за G. stearothermophilus с оптимална скорост на растеж около 60-65°C. Свържете данните с помощта на кардинален модел (Фигура S5)49, където \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, което се съгласува добре с други стойности, цитирани в литературата49. Въпреки че зависимите от температурата параметри са възпроизводими, максималната скорост на растеж на \({G}_{0}\) може да варира от един експеримент на друг (вижте фигури S7-S9 и филм M4). За разлика от температурните параметри, които трябва да бъдат универсални, максималната скорост на растеж зависи от свойствата на средата (наличие на хранителни вещества, концентрация на кислород) в рамките на наблюдаваната геометрия на микромащаба.
микробен растеж при различни температури. mCFU: Миниатюрни единици за формиране на колонии. Данни, получени от видеозапис на една бактерия, растяща в температурен градиент (филм M3). b Същото като (a), полулогаритмична скала. c Скорост на растеж\(\tau\) и време на генериране\(g\), изчислени от линейна регресия (b). Хоризонтални ленти за грешки: температурен диапазон, при който mCFUs се разширяват в зрителното поле по време на растеж. Вертикални ленти за грешки: стандартна грешка на линейна регресия.
В допълнение към нормалния растеж, някои бактерии понякога изплуваха в полезрението по време на лазерно нагряване, което е очаквано поведение за бактерии с флагели. Филмът M5 в допълнителна информация показва такива дейности по плуване. В този експеримент беше използвано равномерно лазерно лъчение за създаване на температурен градиент, както е показано на фигури 1d, e и S3. Фигура 5 показва две последователности от изображения, избрани от филма M5, показващи, че една бактерия проявява насочено движение, докато всички други бактерии остават неподвижни.
Двете времеви рамки (a) и (b) показват плуването на две различни бактерии, маркирани с пунктирани кръгове. Изображенията са извлечени от филма M5 (предоставен като допълнителен материал).
При G. stearothermophilus активното движение на бактериите (фиг. 5) започва няколко секунди след включването на лазерния лъч. Това наблюдение подчертава временния отговор на този термофилен микроорганизъм към повишаване на температурата, както вече беше наблюдавано от Mora et al. 24 . Темата за подвижността на бактериите и дори термотаксиса може да бъде допълнително проучена с помощта на LA-HTM.
Микробното плуване не трябва да се бърка с други видове физическо движение, а именно (i) Брауново движение, което изглежда като хаотично движение без определена посока, (ii) конвекция 50 и термофореза 43, състоящи се в редовно движение на движение по температура градиент.
G. stearothermophilus е известен със способността си да произвежда силно устойчиви спори (образуване на спори), когато е изложен на неблагоприятни условия на околната среда като защита. Когато условията на околната среда отново станат благоприятни, спорите покълват, образувайки живи клетки и възобновявайки растежа си. Въпреки че този процес на спорулация/покълване е добре известен, той никога не е бил наблюдаван в реално време. Използвайки LA-HTM, ние докладваме тук първото наблюдение на събития на покълване в G. stearothermophilus.
На фиг. 6а показва изображения с изтичане на времето на оптична дълбочина (OT), получени с помощта на CGM набор от 13 спори. За цялото време на събиране (15 h 6 min, \(t=0\) – началото на лазерното нагряване), 4 от 13 спори покълнаха, в последователни времеви точки \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' и \(11\) h \(30\)'. Въпреки че само едно от тези събития е показано на Фигура 6, 4 събития на покълване могат да бъдат наблюдавани във филма M6 в допълнителния материал. Интересното е, че покълването изглежда произволно: не всички спори покълват и не покълват едновременно, въпреки същите промени в условията на околната среда.
времеви снимки, състоящи се от 8 OT изображения (потапяне в масло, 60x, 1,25 NA обектив) и (b) еволюция на биомасата на агрегати от G. stearothermophilus. c (b) Начертано в полулогаритмична скала, за да се подчертае линейността на скоростта на растеж (пунктирана линия).
На фиг. 6b, c показва биомасата на клетъчните популации в зрителното поле като функция на времето през целия период на събиране на данни. Бързото разпадане на сухата маса, наблюдавано при \(t=5\)h на фиг. 6b, c, поради излизането на някои клетки от зрителното поле. Скоростта на нарастване на тези четири събития е \(0,77\pm 0,1\) h-1. Тази стойност е по-висока от скоростта на растеж, свързана с Фигура 3. 3 и 4, където клетките растат нормално. Причината за повишената скорост на растеж на G. stearothermophilus от спори е неясна, но тези измервания подчертават интереса на LA-HTM и работят на ниво единична клетка (или на ниво на единична mCFU), за да научат повече за динамиката на клетъчния живот .
За да демонстрираме допълнително гъвкавостта на LA-HTM и неговата производителност при високи температури, ние изследвахме растежа на Sulfolobus shibatae, хипертермофилна ацидофилна архея с оптимална температура на растеж 80°C51. В сравнение с G. stearothermophilus, тези археи също имат много различна морфология, наподобяваща 1 микрон сфери (коки), а не удължени пръчки (бацили).
Фигура 7а се състои от последователни изображения с оптична дълбочина на S. shibatae mCFU, получени с помощта на CGM (вижте M7 игрален филм в Допълнителни материали). Този mCFU расте при около 73°C, под оптималната температура от 80°C, но в рамките на температурния диапазон за активен растеж. Наблюдавахме множество събития на делене, които направиха mCFUs да изглеждат като микрогроздове от археи след няколко часа. От тези OT изображения биомасата на mCFU беше измерена във времето и представена на Фигура 7b. Интересно е, че mCFUs на S. shibatae показват линеен растеж, а не експоненциалния растеж, наблюдаван при mCFUs на G. stearothermophilus. Има дългогодишна дискусия 52 относно естеството на темповете на растеж на клетките: докато някои проучвания съобщават за темпове на растеж на микроби, които са пропорционални на техния размер (експоненциален растеж), други показват постоянна скорост (линеен или билинеен растеж). Както е обяснено от Tzur et al. Както е обяснено от Tzur et al. Както обясниха Cur и др.53, различното експоненциално и (би)линейно нарастване изисква точност <6% в измерванията на биомасата, което е недостижимо за повечето методи QPM, дори при използване на интерферометрии. Както е обяснено от Zur et al.Както е обяснено от Zur et al. 53, разграничаването между експоненциален и (би)линеен растеж изисква по-малко от 6% точност при измерванията на биомасата, което е недостижимо за повечето QPM методи, дори когато се използва интерферометрия. CGM постига тази точност с точност под pg при измервания на биомаса36,48.
изтичане на времето, състоящо се от 6 OT изображения (потапяне в масло, 60x, NA обектив 1,25) и (b) развитие на микро-CFU биомаса, измерено с CGM. Вижте филм M7 за повече информация.
Перфектно линейният растеж на S. shibatae е неочакван и все още не е докладван. Въпреки това се очаква експоненциален растеж, най-малкото защото с течение на времето трябва да се появят множество деления на 2, 4, 8, 16 ... клетки. Ние предположихме, че линейният растеж може да се дължи на клетъчно инхибиране поради плътно клетъчно опаковане, точно както клетъчният растеж се забавя и в крайна сметка достига латентно състояние, когато клетъчната плътност е твърде висока.
Завършваме, като обсъждаме следните пет точки на интерес на свой ред: намаляване на обема на нагряване, намаляване на термичната инерция, интерес към златните наночастици, интерес към количествената фазова микроскопия и възможен температурен диапазон, в който може да се използва LA-HTM.
В сравнение с резистивното нагряване, лазерното нагряване, използвано за разработване на HTM, предлага няколко предимства, които илюстрираме в това проучване. По-специално, в течни среди в зрителното поле на микроскопа обемът на нагряване се поддържа в рамките на няколко (10 μm) 3 обема. По този начин само наблюдаваните микроби са активни, докато други бактерии са латентни и могат да се използват за по-нататъшно изследване на пробата – няма нужда да се сменя пробата всеки път, когато трябва да се провери нова температура. Освен това нагряването в микромащаб позволява директно изследване на широк диапазон от температури: Фигура 4c е получена от 3-часов филм (Филм M3), който обикновено изисква подготовката и изследването на няколко проби – по една за всяка от изследваните проби. y е температурата, представляваща броя на дните в експеримента. Намаляването на нагрятия обем също така поддържа всички околни оптични компоненти на микроскопа, особено лещата на обектива, при стайна температура, което беше основен проблем, пред който е изправена общността досега. LA-HTM може да се използва с всякакви лещи, включително маслени имерсионни лещи, и ще остане на стайна температура дори при екстремни температури в зрителното поле. Основното ограничение на метода на лазерно нагряване, което докладваме в това проучване, е, че клетките, които не се прилепват или плават, може да са далеч от зрителното поле и трудни за изследване. Заобиколно решение може да бъде използването на лещи с ниско увеличение, за да се постигне по-голямо повишаване на температурата над няколкостотин микрона. Тази предпазливост е придружена от намаляване на пространствената разделителна способност, но ако целта е да се изследва движението на микроорганизми, не е необходима висока пространствена разделителна способност.
Времевата скала за отопление (и охлаждане) на системата \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) зависи от нейния размер, съгласно закона \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), където \ (L\ ) е характерният размер на източника на топлина (диаметърът на лазерния лъч в нашето изследване е \(L\ около 100\) μm), \(D\) е коефициентът на топлинна дифузия на околната среда (среден в нашия кутия, стъкло и вода Скорост на дифузия\(D\около 2\кратно {10}^{-7}\) m2/s Следователно, в това изследване, времеви реакции от порядъка на 50 ms, т.е. квазимигновени). могат да се очакват температурни промени. Това моментално установяване на повишаване на температурата не само съкращава продължителността на експеримента, но също така позволява прецизно време \(t=0\) за всяко динамично изследване на температурните ефекти.
Предложеният от нас метод е приложим за всеки светлопоглъщащ субстрат (например търговски проби с ITO покритие). Въпреки това, златните наночастици са в състояние да осигурят висока абсорбция в инфрачервения диапазон и ниска абсорбция във видимия диапазон, като последните характеристики са от интерес за ефективно оптично наблюдение във видимия диапазон, особено при използване на флуоресценция. В допълнение, златото е биосъвместимо, химически инертно, оптичната плътност може да се регулира от 530 nm до близка инфрачервена, а подготовката на пробата е проста и икономична29.
Микроскопията на вълновия фронт на напречната решетка (CGM) позволява не само картографиране на температурата в микромащаб, но и мониторинг на биомасата, което я прави особено полезна (ако не е необходима) в комбинация с LA-HTM. През последното десетилетие бяха разработени други техники за температурна микроскопия, особено в областта на биоизобразяването, и повечето от тях изискват използването на чувствителни към температура флуоресцентни сонди 54, 55. Тези методи обаче са критикувани и някои доклади измерват нереалистични температурни промени в клетките, вероятно поради факта, че флуоресценцията зависи от много фактори, различни от температурата. Освен това повечето флуоресцентни сонди са нестабилни при високи температури. Следователно QPM и по-специално CGM представляват идеална техника за температурна микроскопия за изследване на живота при високи температури с помощта на оптична микроскопия.
Изследвания на S. shibatae, които живеят оптимално при 80°C, показват, че LA-HTM може да се приложи за изследване на хипертермофили, а не само на обикновени термофили. По принцип няма ограничение за диапазона от температури, които могат да бъдат достигнати с помощта на LA-HTM и дори температури над 100°C могат да бъдат достигнати при атмосферно налягане без кипене, както демонстрира нашата група от 38 в приложения на хидротермалната химия при атмосферно налягане A. Лазер се използва за нагряване на златни наночастици 40 по същия начин. По този начин LA-HTM има потенциала да се използва за наблюдение на безпрецедентни хипертермофили със стандартна оптична микроскопия с висока разделителна способност при стандартни условия (т.е. при стрес от околната среда).
Всички експерименти бяха извършени с помощта на домашен микроскоп, включително осветление на Köhler (с LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), държач за проби с ръчно движение на xy, обективи (Olympus, 60x, 0,7 NA, въздух, LUCPlanFLN60X или 60x, 1,25 NA, масло , UPLFLN60XOI), CGM камера (QLSI кръстосана решетка, стъпка 39 µm, 0,87 mm от сензор на камерата Andor Zyla) за осигуряване на изображения на интензитет и фронт на вълната и sCMOS камера (ORCA Flash 4.0 V3, 16-битов режим, от Hamamatsu) за запис на данни, показани на фигура 5 (бактериално плуване). Дихроичният разделител на лъчи е 749 nm BrightLine edge (Semrock, FF749-SDi01). Филтърът в предната част на камерата е късопропускащ филтър 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Лазер с титаниев сапфир (лазер Verdi G10, 532 nm, 10 W, изпомпвана лазерна кухина цунами, Spectra-Physics на Фиг. 2-5, допълнително заменен от лазер Millenia, Spectraphysics 10 W, изпомпвана лазерна кухина Mira, Coherent, за Фиг. 2 -5). 6 и 7) са настроени на дължина на вълната \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, което съответства на спектъра на плазмонния резонанс на златни наночастици. Пространствени светлинни модулатори (1920 × 1152 пиксела) са закупени от Meadowlark Optics са изчислени с помощта на алгоритъма Gerchberg-Saxton, както е описано във връзката.
Микроскопията с вълнов фронт на кръстосана решетка (CGM) е оптична микроскопска техника, базирана на комбиниране на двуизмерна дифракционна решетка (известна също като кръстосана решетка) на разстояние един милиметър от сензора на конвенционална камера. Най-често срещаният пример за CGM, който сме използвали в това изследване, се нарича интерферометър с напречно изместване с четири дължини на вълната (QLSI), където кръстосаната решетка се състои от шахматен модел на интензитет/фаза, въведен и патентован от Primot et al. през 200034. Вертикалните и хоризонталните решетъчни линии създават подобни на решетка сенки върху сензора, чието изкривяване може да бъде цифрово обработено в реално време, за да се получи оптичното изкривяване на вълновия фронт (или еквивалентен фазов профил) на падащата светлина. Когато се използва на микроскоп, CGM камера може да покаже оптичната разлика в пътя на изобразен обект, известна също като оптична дълбочина (OT), с чувствителност от порядъка на нанометри36. При всяко CGM измерване, за да се елиминират всякакви дефекти в оптичните компоненти или лъчи, трябва да се вземе първично референтно OT изображение и да се извади от всички следващи изображения.
Температурната микроскопия се извършва с помощта на CGM камера, както е описано в справката. 32. Накратко, нагряването на течност променя нейния индекс на пречупване, създавайки ефект на термична леща, който изкривява падащия лъч. Това изкривяване на вълновия фронт се измерва от CGM и се обработва с помощта на алгоритъм за деконволюция, за да се получи триизмерно разпределение на температурата в течната среда. Ако златните наночастици са равномерно разпределени в пробата, температурното картографиране може да се направи в зони без бактерии, за да се получат по-добри изображения, което понякога правим. Референтното CGM изображение е получено без нагряване (с изключен лазер) и впоследствие е заснето на същото място в изображението с включен лазер.
Измерването на суха маса се постига с помощта на същата CGM камера, използвана за температурни изображения. CGM референтните изображения бяха получени чрез бързо преместване на пробата в x и y по време на експозиция като средство за осредняване на всяка нехомогенност в OT поради наличието на бактерии. От OT изображения на бактерии, тяхната биомаса е получена с помощта на ансамбъл от изображения върху области, избрани с помощта на алгоритъма за домашно сегментиране на Matlab (вижте подраздел „Числен код“), следвайки процедурата, описана в реф. 48. Накратко, използваме релацията \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), където \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) е изображението с оптична дълбочина, \(m\) е сухото тегло и \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) е константа. Избрахме \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, което е типична константа за живи клетки.
Покривно стъкло с диаметър 25 mm и дебелина 150 µm, покрито със златни наночастици, се поставя в камера AttofluorTM (Thermofisher) със златните наночастици, обърнати нагоре. Geobacillus stearothermophilus се култивира предварително за една нощ в LB среда (200 rpm, 60°C) преди всеки ден от експериментите. Капка от 5 µl от суспензия на G. stearothermophilus с оптична плътност (OD) от 0,3 до 0,5 се поставя върху покривно стъкло със златни наночастици. След това кръгло покривно стъкло с диаметър 18 mm с отвор с диаметър 5 mm в центъра се пуска върху капката и 5 μl бактериална суспензия със същата оптична плътност се прилага многократно в центъра на отвора. Ямките върху покривните стъкла се приготвят в съответствие с процедурата, описана в реф. 45 (вижте Допълнителна информация за повече информация). След това добавете 1 ml LB среда към покривното стъкло, за да предотвратите изсъхването на течния слой. Последното покривно стъкло се поставя върху затворения капак на камерата Attofluor™, за да се предотврати изпаряването на средата по време на инкубацията. За експерименти с покълване използвахме спори, които след конвенционални експерименти понякога покриваха горното покривно стъкло. Подобен метод е използван за получаване на Sulfolobus shibatae. Три дни (200 rpm, 75°C) на предварително култивиране на Thiobacillus serrata бяха проведени в среда 182 (DSMZ).
Проби от златни наночастици бяха приготвени чрез мицеларна блок съполимерна литография. Този процес е описан подробно в гл. 60. Накратко, мицели, капсулиращи златни йони, бяха синтезирани чрез смесване на съполимера с HAuCl4 в толуен. След това почистените покривни стъкла се потапят в разтвора и се третират с UV облъчване в присъствието на редуциращ агент, за да се получат златни семена. Накрая, златните семена бяха отгледани чрез контакт на покривно стъкло с воден разтвор на KAuCl4 и етаноламин в продължение на 16 минути, което доведе до квазипериодично и много равномерно подреждане на несферични златни наночастици в близкия инфрачервен диапазон.
За да конвертираме интерферограмите в OT изображения, използвахме домашен алгоритъм, както е описано подробно във връзката. 33 и се предлага като пакет Matlab в следното публично хранилище: https://github.com/baffou/CGMprocess. Пакетът може да изчислява интензитет и OT изображения въз основа на записани интерферограми (включително референтни изображения) и разстояния на матрицата на камерите.
За да изчислим фазовия модел, приложен към SLM, за да получим даден температурен профил, използвахме предварително разработен домашен алгоритъм39, 42, който е достъпен в следното публично хранилище: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Входът е желаното температурно поле, което може да се зададе цифрово или чрез монохромно bmp изображение.
За да сегментираме клетките и да измерим тяхното сухо тегло, използвахме нашия алгоритъм Matlab, публикуван в следното публично хранилище: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. На всяко изображение потребителят трябва да щракне върху бактерията или mCFU от интерес, да регулира чувствителността на пръчката и да потвърди избора.
За повече информация относно дизайна на изследването вижте резюмето на доклада за изследване на природата, свързано с тази статия.
Данните в подкрепа на резултатите от това проучване са достъпни от съответните автори при разумно искане.
Изходният код, използван в това проучване, е подробно описан в раздела Методи, а версиите за отстраняване на грешки могат да бъдат изтеглени от https://github.com/baffou/ в следните хранилища: SLM_temperatureShaping, CGMprocess и CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Вникване в термофилите и техните широкоспектърни приложения. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Вникване в термофилите и техните широкоспектърни приложения.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. и Sharma, AK Преглед на термофилите и тяхното широко приложение. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамле, Д. и Шарма, АК.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. и Sharma AK Дълбоко разбиране на термофилите и широк спектър от приложения.3 Биотехнология 6, 81 (2016).
Време на публикуване: 26 септември 2022 г