При болестта на Алцхаймер (AD) липсват протеинови биомаркери, които отразяват многобройната основна патофизиология, възпрепятствайки напредъка на диагностиката и лечението. Тук използваме цялостна протеомика, за да идентифицираме биомаркери на цереброспиналната течност (CSF), които представляват широк спектър от патофизиология на AD. Мултиплексната масспектрометрия идентифицира приблизително 3500 и приблизително 12 000 протеина в AD CSF и съответно в мозъка. Мрежовият анализ на мозъчния протеом разрешава 44 модула на биоразнообразието, 15 от които се припокриват с протеома на цереброспиналната течност. CSF AD маркерите в тези припокриващи се модули са сгънати в пет протеинови групи, представляващи различни патофизиологични процеси. Синапсите и метаболитите в мозъка на AD намаляват, но CSF се увеличава, докато богатата на глия миелинизация и имунните групи в мозъка и CSF се увеличават. Консистенцията и специфичността на заболяването на промените в панела бяха потвърдени в повече от 500 допълнителни проби от CSF. Тези групи също идентифицират биологични подгрупи при асимптоматична AD. Като цяло, тези резултати са обещаваща стъпка към уеб-базирани инструменти за биомаркери за клинични приложения при AD.
Болестта на Алцхаймер (AD) е най-честата причина за невродегенеративна деменция в световен мащаб и се характеризира с широк спектър от дисфункции на биологичната система, включително синаптично предаване, глиално-медииран имунитет и митохондриален метаболизъм (1-3). Въпреки това, неговите установени протеинови биомаркери все още се фокусират върху откриването на амилоид и тау протеин и следователно не могат да отразяват тази разнообразна патофизиология. Тези "основни" протеинови биомаркери, които са най-надеждно измерени в цереброспиналната течност (CSF), включват (i) амилоид бета пептид 1-42 (Aβ1-42), който отразява образуването на кортикални амилоидни плаки; (ii) общ тау, признак на дегенерация на аксон; (iii) фосфо-тау (р-тау), представител на патологично тау хиперфосфорилиране (4-7). Въпреки че тези биомаркери на гръбначно-мозъчната течност значително улесниха откриването ни на „маркирани“ протеинови заболявания на AD (4-7), те представляват само малка част от сложната биология зад болестта.
Липсата на патофизиологично разнообразие на биомаркери за AD доведе до много предизвикателства, включително (i) невъзможността да се идентифицира и количествено определи биологичната хетерогенност на пациенти с AD, (ii) недостатъчно измерване на тежестта и прогресията на заболяването, особено в предклиничния стадий, и ( iii) разработването на терапевтични лекарства, които не успяха да решат напълно всички аспекти на неврологичното влошаване. Нашето разчитане на забележителна патология, за да опишем AD от свързани заболявания, само изостря тези проблеми. Все повече и повече доказателства показват, че повечето възрастни хора с деменция имат повече от една патологична характеристика на когнитивен спад (8). До 90% или повече от индивидите с AD патология също имат съдово заболяване, TDP-43 включвания или други дегенеративни заболявания (9). Тези високи пропорции на патологично припокриване са нарушили настоящата ни диагностична рамка за деменция и е необходима по-всеобхватна патофизиологична дефиниция на заболяването.
С оглед на спешната нужда от разнообразие от биомаркери на AD, полето все повече възприема метода „omics“, базиран на цялостната система за откриване на биомаркери. Алиансът Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD стартира през 2014 г. и е в челните редици на програмата. Това мултидисциплинарно усилие на Националните институти по здравеопазване, академичните среди и индустрията има за цел да използва системно базирани стратегии за по-добро дефиниране на патофизиологията на AD и разработване на диагностичен анализ на биоразнообразието и стратегии за лечение (10). Като част от този проект мрежовата протеомика се превърна в обещаващ инструмент за напредъка на системно базирани биомаркери в AD. Този безпристрастен подход, управляван от данни, организира сложни набори от протеомични данни в групи или „модули“ от ко-експресирани протеини, които са свързани със специфични типове клетки, органели и биологични функции (11-13). Бяха проведени почти 12 богати на информация мрежови протеомични изследвания върху мозъка на AD (13-23). Като цяло, тези анализи показват, че протеомът на мозъчната мрежа на AD поддържа силно запазена модулна организация в независими кохорти и множество кортикални региони. В допълнение, някои от тези модули показват възпроизводими промени в свързаното с AD изобилие в набори от данни, отразяващи патофизиологията на множество заболявания. Взети заедно, тези открития демонстрират обещаваща опорна точка за откриването на протеома на мозъчната мрежа като системно базиран биомаркер при AD.
За да трансформираме протеома на мозъчната мрежа на AD в клинично полезни системни биомаркери, ние комбинирахме мрежата, получена от мозъка, с протеомния анализ на AD CSF. Този интегриран подход доведе до идентифицирането на пет обещаващи набора от биомаркери на CSF, които са свързани с широк спектър от мозъчна патофизиология, включително синапси, кръвоносни съдове, миелинизация, възпаление и дисфункция на метаболитни пътища. Ние успешно валидирахме тези биомаркерни панели чрез множество репликационни анализи, включително повече от 500 CSF проби от различни невродегенеративни заболявания. Тези валидиращи анализи включват изследване на групови цели в CSF на пациенти с асимптоматична AD (AsymAD) или показване на доказателства за анормално натрупване на амилоид в нормална когнитивна среда. Тези анализи подчертават значителната биологична хетерогенност в популацията на AsymAD и идентифицират панелни маркери, които могат да бъдат в състояние да подтипират индивиди в най-ранните стадии на заболяването. Като цяло, тези резултати представляват ключова стъпка в разработването на инструменти за протеинови биомаркери, базирани на множество системи, които могат успешно да разрешат много от клиничните предизвикателства, пред които е изправен AD.
Основната цел на това проучване е да идентифицира нови биомаркери на цереброспиналната течност, които отразяват различни мозъчно базирани патофизиологии, които водят до AD. Фигура S1 очертава нашата изследователска методология, която включва (i) цялостен анализ, воден от предварителните констатации на AD CSF и мрежовия мозъчен протеом за идентифициране на множество свързани с мозъка биомаркери на заболяване на CSF, и (ii) последваща репликация. Тези биомаркери са в няколко независими цереброспинални течни кохорти. Изследването, ориентирано към откритията, започна с анализ на диференциалната експресия на CSF при 20 когнитивно нормални индивида и 20 пациенти с AD в Центъра за изследване на болестта на Алцхаймер на Emory Goizueta (ADRC). Диагнозата AD се дефинира като значително когнитивно увреждане при наличие на нисък Aβ1-42 и повишени нива на общия tau и p-tau в гръбначно-мозъчната течност [Средна Монреалска когнитивна оценка (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA )]] (Таблица S1A). Контролата (среден MoCA, 26,7 ± 2,2) има нормални нива на биомаркери на CSF.
Човешкият CSF се характеризира с динамичен диапазон на изобилие на протеини, в който албуминът и други изключително изобилни протеини могат да попречат на откриването на протеини, представляващи интерес (24). За да увеличим дълбочината на откриване на протеини, ние премахнахме първите 14 силно изобилни протеина от всяка проба от CSF преди масспектрометричен (MS) анализ (24). Общо 39 805 пептида бяха идентифицирани от MS, които бяха картографирани в 3691 протеома в 40 проби. Количественото определяне на протеина се извършва чрез маркиране с множество тандемни масови маркери (TMT) (18, 25). За да разрешим липсващите данни, ние включихме само онези протеини, които бяха количествено определени в поне 50% от пробите в последващия анализ, като по този начин накрая количествено определихме 2875 протеома. Поради значителната разлика в нивата на общото изобилие на протеини, контролна проба статистически се счита за отклонение (13) и не е включена в последващия анализ. Стойностите на изобилието на останалите 39 проби бяха коригирани според възрастта, пола и партидната ковариация (13-15, 17, 18, 20, 26).
Използвайки статистически t-тест анализ за оценка на диференциалната експресия на регресионния набор от данни, този анализ идентифицира протеини, чиито нива на изобилие са значително променени (P <0.05) между контролните и AD случаи (Таблица S2A). Както е показано на Фигура 1А, изобилието от общо 225 протеина в AD е значително намалено, а изобилието от 303 протеина е значително увеличено. Тези диференциално експресирани протеини включват няколко предварително идентифицирани AD маркера на цереброспиналната течност, като протеин тау, свързан с микротубули (MAPT; P = 3,52 × 10-8), неврофиламент (NEFL; P = 6,56 × 10-3), свързан с растежа протеин 43 (GAP43; P = 1,46 × 10-5), протеин за свързване на мастни киселини 3 (FABP3; P = 2,00 × 10-5), хитиназа 3 като 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10-6), нервен гранулин (NRGN; P = 3,43 × 10-4) и VGF нервен растежен фактор (VGF; P = 4,83 × 10-3) (4-6). Въпреки това, ние също идентифицирахме други много важни цели, като инхибитор на дисоциация на GDP 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) и свързано със SPARC модулно свързване на калций 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9) . Анализът на генната онтология (GO) на 225 значително редуцирани протеини разкрива тесни връзки с процесите на телесните течности като стероиден метаболизъм, коагулация на кръвта и хормонална активност (Фигура 1B и Таблица S2B). Обратно, значително повишеният протеин на 303 е тясно свързан с клетъчната структура и енергийния метаболизъм.
(A) Графиката на вулкана показва log2 кратната промяна (ос x) спрямо -log10 статистическата P стойност (y-ос), получена от t-теста, който се използва за откриване на диференциална експресия между контролата (CT) и AD случаи на CSF протеома на всички протеини. Протеини със значително намалени нива (P <0,05) при AD са показани в синьо, докато протеини със значително повишени нива при заболяване са показани в червено. Избраният протеин е етикетиран. (B) Горните GO термини, свързани с протеина, са значително намалени (синьо) и увеличени (червено) при AD. Показва трите термина на GO с най-високи z-резултати в областта на биологичните процеси, молекулярните функции и клетъчните компоненти. (C) MS измерено ниво на MAPT в CSF проба (вляво) и неговата корелация с пробата ELISA tau ниво (вдясно). Показва се корелационният коефициент на Pearson със съответната P стойност. Поради липсата на ELISA данни за един случай на AD, тези цифри включват стойности за 38 от 39 анализирани случая. (D) Наблюдаван клъстерен анализ (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) коригиран P <0,01) върху контролата и AD CSF намери проби, използвайки 65-те най-значително променени протеини в набора от данни. Стандартизирайте, нормализирайте.
Протеомното ниво на MAPT е тясно свързано с независимо измереното ниво на тау ELISA (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Фигура 1C), подкрепяйки валидността на нашето MS измерване. След смилане на трипсин на нивото на амилоиден прекурсорен протеин (АРР), специфичните за изоформите пептиди, нанесени към С-края на Aβ1-40 и Aβ1-42, не могат да бъдат йонизирани ефективно (27, 28). Следователно, APP пептидите, които идентифицирахме, нямат нищо общо с нивата на ELISA Aβ1-42. За да оценим диференциалната експресия на всеки случай, ние използвахме диференциално експресирани протеини с P <0.0001 [степен на фалшиво откриване (FDR), коригирана P <0.01], за да извършим контролиран клъстерен анализ на пробите (Таблица S2A). Както е показано на Фигура 1D, тези 65 високо значими протеина могат правилно да групират проби според болестното състояние, с изключение на един случай на AD с контролни характеристики. От тези 65 протеина, 63 се повишават при AD, докато само два (CD74 и ISLR) намаляват. Общо тези анализи на цереброспиналната течност са идентифицирали стотици протеини в AD, които могат да служат като биомаркери на заболяването.
След това извършихме независим мрежов анализ на мозъчния протеом на AD. Мозъчната кохорта на това откритие включва дорзолатерален префронтален кортекс (DLPFC) от контрола (n = 10), болест на Паркинсон (PD; n = 10), смесени случаи на AD/PD (n = 10) и AD (n = 10). ) Проба. Emery Goizueta ADRC. Демографията на тези 40 случая е описана по-рано (25) и е обобщена в таблица S1B. Използвахме TMT-MS, за да анализираме тези 40 мозъчни тъкани и репликационната група от 27 случая. Общо тези два набора данни за мозъка произвеждат 227 121 уникални пептида, които са картографирани в 12 943 протеоми (25). Само онези протеини, които са количествено определени в поне 50% от случаите, са включени в последващи изследвания. Окончателният набор от данни за откритието съдържа 8817 количествено определени протеини. Коригирайте нивата на изобилие от протеин въз основа на възрастта, пола и следсмъртния интервал (PMI). Анализът на диференциалната експресия на набора от данни след регресия показа, че >2000 протеинови нива са значително променени [P <0,05, дисперсионен анализ (ANOVA)] в две или повече кохорти на заболяването. След това извършихме контролиран клъстерен анализ въз основа на диференциално експресираните протеини и P <0,0001 в AD/контрола и/или AD/PD сравнения (Фигура S2, A и B, Таблица S2C). Тези 165 силно променени протеина ясно изобразяват случаи с AD патология от контролните и PD проби, потвърждавайки силните AD-специфични промени в целия протеом.
След това използвахме алгоритъм, наречен Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA), за да извършим мрежов анализ на открития мозъчен протеом, който организира набора от данни в протеинови модули с подобни модели на експресия (11-13). Анализът идентифицира 44 модула (M) ко-експресирани протеини, сортирани и номерирани от най-големия (M1, n = 1821 протеина) до най-малкия (M44, n = 34 протеина) (Фигура 2A и Таблица S2D)). Както бе споменато по-горе (13) Изчислете представителния профил на експресия или характерния протеин на всеки модул и го съпоставете с болестното състояние и патологията на AD, т.е. установете съюза на регистъра на болестта на Алцхаймер (CERAD) и резултата на Braak (Фигура 2B). Като цяло, 17 модула са значително свързани с невропатологията на AD (P <0,05). Много от тези модули, свързани със заболяването, също са богати на специфични за клетъчния тип маркери (Фигура 2B). Както бе споменато по-горе (13), обогатяването на клетъчния тип се определя чрез анализиране на припокриването на модула и референтния списък на гени, специфични за клетъчния тип. Тези гени са извлечени от публикувани данни в изолирани миши неврони, ендотелни и глиални клетки. Експеримент за секвениране на РНК (RNA-seq) (29).
(A) Открийте WGCNA на мозъчния протеом. (B) Анализ на двустепенна средна корелация (BiCor) на модулния сигнатурен протеин (първият основен компонент на експресията на модулен протеин) с AD невропатологични характеристики (отгоре), включително CERAD (Aβ плака) и Braak (tau tangles) резултати. Интензитетите на положителните (червени) и отрицателните (сини) корелации са показани чрез двуцветна топлинна карта, а звездичките показват статистическа значимост (P <0.05). Използвайте Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (отдолу), за да оцените асоциацията на клетъчния тип на всеки протеинов модул. Интензитетът на червеното оцветяване показва степента на обогатяване на клетъчния тип, а звездичката показва статистическа значимост (P <0.05). Използвайте метода BH, за да коригирате P стойността, получена от FET. (C) GO анализ на модулни протеини. Най-тясно свързаните биологични процеси са показани за всеки модул или свързана модулна група. олиго, олигодендроцит.
Набор от пет тясно свързани модула, богати на астроцити и микроглия (M30, M29, M18, M24 и M5), показва силна положителна корелация с невропатологията на AD (Фигура 2B). Онтологичният анализ свързва тези глиални модули с клетъчния растеж, пролиферация и имунитет (Фигура 2C и Таблица S2E). Два допълнителни глиални модула, M8 и M22, също са силно регулирани нагоре при заболяване. M8 е силно свързан с Toll-подобния рецепторен път, сигнална каскада, която играе ключова роля във вродения имунен отговор (30). В същото време M22 е тясно свързан с пост-транслационната модификация. M2, който е богат на олигодендроцити, показва силна положителна корелация с патологията на AD и онтологична връзка с нуклеозидния синтез и репликацията на ДНК, което показва повишена клетъчна пролиферация при заболявания. Като цяло, тези констатации подкрепят повишаването на глиалните модули, които преди това сме наблюдавали в AD мрежовия протеом (13, 17). Понастоящем е установено, че много свързани с AD глиални модули в мрежата показват по-ниски нива на експресия в контролни и PD случаи, подчертавайки тяхната специфичност на заболяването, която е повишена при AD (Фигура S2C).
Само четири модула в нашия мрежов протеом (M1, M3, M10 и M32) са силно отрицателно свързани с патологията на AD (P <0, 05) (Фигура 2, B и C). И M1, и M3 са богати на невронни маркери. M1 е тясно свързан със синаптичните сигнали, докато M3 е тясно свързан с митохондриалната функция. Няма доказателства за обогатяване на клетъчен тип за M10 и M32. M32 отразява връзката между M3 и клетъчния метаболизъм, докато M10 е силно свързан с клетъчния растеж и функцията на микротубулите. В сравнение с AD, всичките четири модула са увеличени в контрола и PD, което им дава специфични за заболяването промени в AD (Фигура S2C). Като цяло, тези резултати подкрепят намаленото изобилие от модули, богати на неврони, които преди това сме наблюдавали при AD (13, 17). В обобщение, мрежовият анализ на мозъчния протеом, който открихме, произведе специфично за AD модули, променени в съответствие с нашите предишни открития.
AD се характеризира с ранен асимптоматичен стадий (AsymAD), в който индивидите показват натрупване на амилоид без клиничен когнитивен спад (5, 31). Този асимптоматичен стадий представлява критичен прозорец за ранно откриване и намеса. По-рано демонстрирахме силно модулно запазване на протеома на мозъчната мрежа AsymAD и AD в независими набори от данни (13, 17). За да гарантираме, че мозъчната мрежа, която открихме в момента, е в съответствие с тези предишни открития, ние анализирахме запазването на 44 модула в репликирания набор от данни от 27 DLPFC организации. Тези организации включват контролни (n = 10), AsymAD (n = 8) и AD (n = 9) случаи. Контролни и AD проби бяха включени в анализа на нашата мозъчна кохорта за откриване (Таблица S1B), докато случаите на AsymAD бяха уникални само в кохортата за репликация. Тези случаи на AsymAD също идват от мозъчната банка на Emory Goizueta ADRC. Въпреки че когнитивните способности са били нормални по време на смъртта, нивата на амилоид са били необичайно високи (средно CERAD, 2,8 ± 0,5) (Таблица S1B).
TMT-MS анализът на тези 27 мозъчни тъкани доведе до количественото определяне на 11 244 протеома. Това окончателно преброяване включва само онези протеини, определени количествено в поне 50% от пробите. Този репликиран набор от данни съдържа 8638 (98,0%) от 8817 протеини, открити в нашия мозъчен анализ на откритието, и има близо 3000 значително променени протеини между контролната и AD кохорти (P <0,05, след сдвоения t тест на Tukey за анализ на дисперсията) ( Таблица S2F). Сред тези диференциално експресирани протеини, 910 също показа значителни промени в нивата между AD и случаите на контрол на мозъчния протеом (P <0,05, след ANOVA Tukey сдвоен t-тест). Струва си да се отбележи, че тези 910 маркера са силно последователни в посоката на промяна между протеомите (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Фигура S3A). Сред увеличените протеини, протеините с най-последователни промени между наборите от данни са главно членове на богатите на глия M5 и M18 модули (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 и GFAP). Сред намалените протеини, тези с най-последователни промени бяха почти изключително членове на модула M1 (NPTX2, VGF и RPH3A), свързан със синапса. Допълнително проверихме свързаните с AD промени на midkine (MDK), CD44, секретиран протеин 1 (SFRP1) и VGF чрез Western blotting (Фигура S3B). Анализът на запазване на модула показа, че около 80% от протеиновите модули (34/44) в мозъчния протеом са значително запазени в набора от данни за репликация (z-резултат> 1,96, FDR коригиран P <0,05) (Фигура S3C). Четиринадесет от тези модули бяха специално запазени между двата протеома (z-резултат> 10, FDR коригиран P <1.0 × 10-23). Като цяло, откриването и репликацията на високата степен на последователност в диференциалната експресия и модулния състав между мозъчния протеом подчертава възпроизводимостта на промените в протеините на предната кора на AD. В допълнение, той също потвърди, че AsymAD и по-напреднали заболявания имат много подобна структура на мозъчната мрежа.
По-подробен анализ на диференциалната експресия в набора от данни за репликация на мозъка подчертава значителната степен на промени в протеина на AsymAD, включително общо 151 значително променени протеина между AsymAD и контролата (P <0.05) (Фигура S3D). В съответствие с амилоидното натоварване, АРР в мозъка на AsymAD и AD се повишава значително. MAPT се променя значително само при AD, което е в съответствие с повишените нива на заплитане и известната му връзка с когнитивния спад (5, 7). Богатите на глия модули (M5 и M18) са силно отразени в повишените протеини в AsymAD, докато свързаният с неврон M1 модул е най-представителният от намалените протеини в AsymAD. Много от тези маркери на AsymAD показват по-големи промени в симптоматичните заболявания. Сред тези маркери е SMOC1, глиален протеин, принадлежащ към M18, който е свързан с мозъчни тумори и развитието на очите и крайниците (32). MDK е хепарин-свързващ растежен фактор, свързан с клетъчния растеж и ангиогенезата (33), друг член на M18. В сравнение с контролната група, AsymAD се повишава значително, последвано от по-голямо увеличение на AD. Обратно, синаптичният протеин невропентраксин 2 (NPTX2) е значително намален в мозъка на AsymAD. NPTX2 преди това беше свързан с невродегенерация и има призната роля в медиирането на възбудителни синапси (34). Като цяло, тези резултати разкриват разнообразие от различни предклинични протеинови промени при AD, които изглежда прогресират с тежестта на заболяването.
Като се има предвид, че сме постигнали значителна дълбочина на протеиново покритие при откриването на мозъчния протеом, ние се опитваме да разберем по-пълно неговото припокриване с AD транскриптома на мрежово ниво. Затова сравнихме мозъчния протеом, който открихме, с модула, който преди това генерирахме от измерването на микрочипове на 18 204 гена в AD (n = 308) и контролни (n = 157) DLPFC тъкани (13). припокриване. Общо идентифицирахме 20 различни РНК модула, много от които демонстрираха обогатяването на специфични типове клетки, включително неврони, олигодендроцити, астроцити и микроглия (Фигура 3А). Множеството промени на тези модули в AD са показани на фигура 3B. В съответствие с нашия предишен анализ на припокриване протеин-РНК, използвайки по-дълбокия небелязан MS протеом (около 3000 протеина) (13), повечето от 44-те модула в мозъчната протеомна мрежа, които открихме, са в транскриптомната мрежа. Няма значително припокриване. Дори в нашето откритие и репликация на 34 протеинови модула, които са силно задържани в мозъчния протеом, само 14 (~40%) преминаха точния тест на Фишър (FET) се оказа, че имат статистически значимо припокриване с транскриптома (Фигура 3A). Съвместим с възстановяване на увреждане на ДНК (P-M25 и P-M19), протеинова транслация (P-M7 и P-M20), РНК свързване/сплайсинг (P-M16 и P-M21) и протеиново насочване (P-M13 и P- M23) не се припокрива с модули в транскриптома. Следователно, въпреки че в настоящия анализ на припокриване се използва по-дълбок набор от данни за протеоми (13), по-голямата част от протеома на AD мрежата не е картографиран към транскриптомната мрежа.
(A) Хипергеометричният FET демонстрира обогатяването на специфични за клетъчния тип маркери в РНК модула на транскриптома на AD (отгоре) и степента на припокриване между модулите на РНК (ос x) и протеин (ос y) на мозъка на AD (отдолу) . Интензитетът на червеното оцветяване показва степента на обогатяване на типовете клетки в горния панел и интензитета на припокриването на модулите в долния панел. Звездичките показват статистическа значимост (P <0,05). (B) Степента на корелация между характерните гени на всеки транскриптомен модул и статуса на AD. Модулите отляво са най-негативно корелирани с AD (синьо), а тези отдясно са най-положително корелирани с AD (червено). Лог-трансформираната BH-коригирана P стойност показва степента на статистическа значимост на всяка корелация. (C) Значителни припокриващи се модули със споделено обогатяване на типа клетка. (D) Корелационен анализ на log2 кратната промяна на белязания протеин (x-ос) и РНК (y-ос) в припокриващия се модул. Показва се корелационният коефициент на Pearson със съответната P стойност. Микро, микроглия; небесни тела, астроцити. КТ, контрол.
Повечето припокриващи се протеинови и РНК модули споделят подобни профили на обогатяване на клетъчен тип и последователни посоки на промяна на AD (Фигура 3, B и C). С други думи, свързаният със синапса М1 модул на мозъчния протеом (PM1) е картографиран към три богати на неврони хомоложни РНК модула (R-M1, R-M9 и R-M16), които са в AD. И двата показаха намалено ниво. По същия начин, богатите на глия M5 и M18 протеинови модули се припокриват с РНК модули, богати на астроцити и микроглиални маркери (R-M3, R-M7 и R-M10) и са силно включени в нарастването на заболяванията. Тези споделени модулни характеристики между двата набора от данни допълнително подкрепят обогатяването на клетъчния тип и свързаните с болестта промени, които сме наблюдавали в мозъчния протеом. Въпреки това, ние наблюдавахме много значителни разлики между РНК и протеиновите нива на отделните маркери в тези споделени модули. Корелационният анализ на диференциалната експресия на протеомиката и транскриптомиката на молекулите в тези припокриващи се модули (Фигура 3D) подчертава това несъответствие. Например, APP и няколко други глиални модулни протеини (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 и SFRP1) показват значително увеличение на AD протеома, но почти няма промяна в AD транскриптома. Тези протеин-специфични промени може да са тясно свързани с амилоидните плаки (23, 35), подчертавайки протеома като източник на патологични промени, и тези промени може да не бъдат отразени в транскриптома.
След независим анализ на откритите от нас протеоми на мозъка и CSF, ние проведохме цялостен анализ на двата набора от данни, за да идентифицираме биомаркери на AD CSF, свързани с патофизиологията на мозъчната мрежа. Първо трябва да определим припокриването на двата протеома. Въпреки че е широко прието, че CSF отразява неврохимичните промени в мозъка на AD (4), точната степен на припокриване между мозъка на AD и протеома на CSF не е ясна. Чрез сравняване на броя на споделените генни продукти, открити в нашите два протеома, открихме, че почти 70% (n = 1936) от протеините, идентифицирани в цереброспиналната течност, също са количествено определени в мозъка (Фигура 4А). Повечето от тези припокриващи се протеини (n = 1721) са картографирани към един от 44 ко-експресионни модула от набора от данни за мозъка за откриване (Фигура 4B). Както се очакваше, шестте най-големи мозъчни модула (M1 до M6) показаха най-голямо количество припокриване на CSF. Има обаче по-малки мозъчни модули (например M15 и M29), които постигат неочаквано висока степен на припокриване, по-голяма от мозъчен модул два пъти по-голям от него. Това ни мотивира да приемем по-подробен, статистически ориентиран метод за изчисляване на припокриването между мозъка и цереброспиналната течност.
(A и B) Протеините, открити в наборите от данни за мозъка за откриване и CSF, се припокриват. Повечето от тези припокриващи се протеини са свързани с един от 44-те модула за ко-експресия на мозъчната мрежа за ко-експресия. (C) Открийте припокриването между протеома на цереброспиналната течност и протеома на мозъчната мрежа. Всеки ред от топлинната карта представлява отделен анализ на припокриване на хипергеометричния FET. Горният ред изобразява припокриването (сиво/черно засенчване) между мозъчния модул и целия протеом на CSF. Вторият ред изобразява, че припокриването между мозъчните модули и CSF протеина (защриховано в червено) е значително повишено при AD (P <0,05). Третият ред показва, че припокриването между мозъчните модули и CSF протеина (синьо оцветяване) е значително понижено при AD (P <0,05). Използвайте метода BH, за да коригирате P стойността, получена от FET. (D) Панел на сгъваемия модул, базиран на асоцииране на тип клетка и свързани термини на GO. Тези панели съдържат общо 271 протеини, свързани с мозъка, които имат значима диференциална експресия в протеома на CSF.
Използвайки едностранни FET, ние оценихме важността на протеиновото припокриване между CSF протеома и отделните мозъчни модули. Анализът разкри, че общо 14 мозъчни модула в набора от данни за CSF имат статистически значими припокривания (FDR коригирано P <0,05) и допълнителен модул (M18), чието припокриване е близко до значимостта (FDR коригирано P = 0,06) (Фигура 4C , горен ред). Ние също се интересуваме от модули, които силно се припокриват с диференциално експресирани CSF протеини. Следователно, ние приложихме два допълнителни FET анализа, за да определим кой от (i) CSF протеинът е значително повишен при AD и (ii) CSF протеинът е значително намален при AD (P <0,05, сдвоен t тест AD/контрола) Мозъчни модули със значимо припокриване между тях. Както е показано в средния и долния ред на Фигура 4C, тези допълнителни анализи показват, че 8 от 44-те мозъчни модула значително се припокриват с протеина, добавен в AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 и M38) . ), докато само два модула (M6 и M15) показват значимо припокриване с намаления протеин в AD CSF. Както се очаква, всичките 10 модула са в 15-те модула с най-голямо припокриване с протеома на CSF. Следователно, ние приемаме, че тези 15 модула са източници с висок добив на мозъчни CSF биомаркери на AD.
Сгънахме тези 15 припокриващи се модула в пет големи протеинови панела въз основа на тяхната близост в дървовидната диаграма на WGCNA и връзката им с клетъчни типове и генна онтология (Фигура 4D). Първият панел съдържа модули, богати на невронни маркери и протеини, свързани със синапса (M1 и M12). Синаптичният панел съдържа общо 94 протеина и нивата в CSF протеома са се променили значително, което го прави най-големият източник на свързани с мозъка CSF маркери сред петте панела. Втората група (M6 и M15) демонстрира тясната връзка с маркерите на ендотелните клетки и съдовото тяло, като „зарастване на рани“ (M6) и „регулиране на хуморалния имунен отговор“ (M15). M15 също е силно свързан с метаболизма на липопротеините, който е тясно свързан с ендотела (36). Съдовият панел съдържа 34 CSF маркера, свързани с мозъка. Третата група включва модули (M2 и M4), които са значително свързани с олигодендроцитни маркери и клетъчна пролиферация. Например термините на онтологията от най-високо ниво на M2 включват „положителна регулация на репликацията на ДНК“ и „процес на биосинтеза на пурин“. Междувременно тези на M4 включват „диференциация на глиални клетки“ и „сегрегация на хромозоми“. Панелът за миелинизация съдържа 49 CSF маркера, свързани с мозъка.
Четвъртата група съдържа най-много модули (M30, M29, M18, M24 и M5) и почти всички модули са значително богати на микроглия и астроцитни маркери. Подобно на панела за миелинизация, четвъртият панел също съдържа модули (M30, M29 и M18), които са тясно свързани с клетъчната пролиферация. Другите модули в тази група са силно свързани с имунологични термини, като „процес на имунен ефект“ (M5) и „регулиране на имунния отговор“ (M24). Глиалната имунна група съдържа 42 CSF маркера, свързани с мозъка. И накрая, последният панел включва 52 маркера, свързани с мозъка, върху четирите модула (M44, M3, M33 и M38), всички от които са върху тялото, свързани със съхранението на енергия и метаболизма. Най-големият от тези модули (M3) е тясно свързан с митохондриите и е богат на неврон-специфични маркери. M38 е един от по-малките членове на модула в този метаболом и също така проявява умерена невронна специфичност.
Като цяло, тези пет панела отразяват широк спектър от клетъчни типове и функции в кората на AD и заедно съдържат 271 свързани с мозъка CSF маркера (Таблица S2G). За да оценим валидността на тези MS резултати, ние използвахме proximity extension assay (PEA), ортогонална технология, базирана на антитяло, с възможности за мултиплексиране, висока чувствителност и специфичност, и повторно анализирахме пробите от цереброспинална течност, които открихме Подгрупа от тези 271 биомаркера (n = 36). Тези 36 цели демонстрират промяната в AD множественото на PEA, което е тясно свързано с нашите базирани на MS констатации (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), което силно потвърди резултатите от нашия цялостен MS анализ (Фигура S4 ).
Биологичните теми, подчертани от нашите пет групи, от синаптичната сигнализация до енергийния метаболизъм, са свързани с патогенезата на AD (1-3). Следователно всичките 15 модула, съдържащи тези панели, са свързани с патологията на AD в мозъчния протеом, който открихме (Фигура 2B). Най-забележимата е високата положителна патологична корелация между нашите глиални модули и силната отрицателна патологична корелация между нашите най-големи невронни модули (M1 и M3). Анализът на диференциалната експресия на нашия репликиран мозъчен протеом (Фигура S3D) също подчертава глиални протеини, получени от M5 и M18. При AsymAD и симптоматична AD, най-увеличените глиални протеини и M1-свързаните синапси. Протеинът е намален най-много. Тези наблюдения показват, че 271 маркера на цереброспиналната течност, които идентифицирахме в петте групи, са свързани с болестни процеси в кората на AD, включително тези, които се появяват в ранните асимптоматични стадии.
За да анализираме по-добре посоката на промяна на панелните протеини в мозъка и гръбначномозъчната течност, ние начертахме следното за всеки от 15-те припокриващи се модула: (i) намерихме нивото на изобилие на модула в набора от мозъчни данни и (ii) модула протеин Разликата се изразява в цереброспиналната течност (Фигура S5). Както бе споменато по-рано, WGCNA се използва за определяне на изобилието на модула или характерната протеинова стойност в мозъка (13). Картата на вулкана се използва за описване на диференциалната експресия на модулни протеини в цереброспиналната течност (AD/контрола). Тези цифри показват, че три от петте панела показват различни тенденции на експресия в мозъка и гръбначномозъчната течност. Двата модула на синапсния панел (M1 и M12) показват намаляване на нивото на изобилие в AD мозъка, но значително се припокриват с увеличения протеин в AD CSF (Фигура S5A). Свързаните с невроните модули, съдържащи метаболома (M3 и M38), показват подобни непоследователни модели на експресия на мозъка и цереброспиналната течност (Фигура S5E). Съдовият панел също показа различни тенденции на експресия, въпреки че неговите модули (M6 и M15) бяха умерено повишени в AD мозъка и намалени в болния CSF (Фигура S5B). Останалите два панела съдържат големи глиални мрежи, чиито протеини са последователно регулирани нагоре и в двете отделения (Фигура S5, C и D).
Моля, обърнете внимание, че тези тенденции не са общи за всички маркери в тези панели. Например, синаптичният панел включва няколко протеина, които са значително намалени в AD мозъка и CSF (Фигура S5A). Сред тези понижено регулирани маркери на цереброспиналната течност са NPTX2 и VGF на M1 и хромогранин B на M12. Въпреки това, въпреки тези изключения, повечето от нашите синаптични маркери са повишени в спиналната течност на AD. Като цяло, тези анализи успяха да разграничат статистически значими тенденции в нивата на мозъка и цереброспиналната течност във всеки от нашите пет панела. Тези тенденции подчертават сложната и често различна връзка между мозъка и експресията на протеин в CSF при AD.
След това използвахме високопроизводителен репликационен анализ на MS (репликация на CSF 1), за да стесним нашия набор от 271 биомаркери до най-обещаващите и възпроизводими цели (Фигура 5А). CSF копие 1 съдържа общо 96 проби от Emory Goizueta ADRC, включително контрола, AsymAD и AD кохорта (Таблица S1A). Тези случаи на AD се характеризират с лек когнитивен спад (среден MoCA, 20,0 ± 3,8) и промени в биомаркерите на AD, потвърдени в цереброспиналната течност (Таблица S1A). Противно на анализа на CSF, който открихме, тази репликация се извършва с помощта на по-ефективен и високопроизводителен „еднократен“ MS метод (без офлайн фракциониране), включително опростен протокол за подготовка на пробите, който елиминира необходимостта от имуносупресия на отделни проби . Вместо това се използва един „канал за подобряване на имунитета“ за усилване на сигнала на протеини с по-малко изобилие (37). Въпреки че намалява общото протеомно покритие, този еднократен метод значително намалява машинното време и увеличава броя на TMT-белязаните проби, които могат да бъдат анализирани жизнеспособни (17, 38). Общо анализът идентифицира 6487 пептида, които са картографирани на 1183 протеома в 96 случая. Както при анализа на CSF, който открихме, само онези протеини, определени количествено в поне 50% от пробите, бяха включени в следващите изчисления и данните бяха регресирани за ефектите на възрастта и пола. Това доведе до окончателното количествено определяне на 792 протеома, 95% от които също бяха идентифицирани в намерения набор от данни за CSF.
(A) Свързани с мозъка CSF протеинови цели, проверени в първата репликирана CSF кохорта и включени в крайния панел (n = 60). (B до E) Панелни нива на биомаркери (композитни z-резултати), измерени в четирите кохорти за репликация на CSF. Сдвоени t-тестове или ANOVA с последваща корекция на Tukey бяха използвани за оценка на статистическата значимост на промените в изобилието при всеки повторен анализ. КТ, контрол.
Тъй като ние сме особено заинтересовани да проверим нашите 271 свързани с мозъка CSF мишени чрез цялостен анализ, ние ще ограничим по-нататъшното изследване на този репликиран протеом до тези маркери. Сред тези 271 протеина, 100 бяха открити в CSF репликация 1. Фигура S6A показва диференциалната експресия на тези 100 припокриващи се маркера между контролните и AD репликационни проби. Синаптичните и метаболитните хистони се увеличават най-много при AD, докато съдовите протеини намаляват най-много при заболяване. Повечето от 100-те припокриващи се маркера (n = 70) поддържат същата посока на промяна в двата набора от данни (Фигура S6B). Тези 70 валидирани мозъчно-свързани CSF маркера (Таблица S2H) до голяма степен отразяват наблюдаваните преди това тенденции на експресия на панели, тоест регулирането надолу на васкуларните протеини и регулирането нагоре на всички други панели. Само 10 от тези 70 валидирани протеини показват промени в изобилието на AD, които противоречат на тези панелни тенденции. За да генерираме панел, който най-добре отразява цялостната тенденция на мозъка и гръбначно-мозъчната течност, ние изключихме тези 10 протеина от интересния панел, който най-накрая проверихме (Фигура 5А). Следователно нашият панел в крайна сметка включва общо 60 протеина, проверени в две независими CSF AD кохорти, използвайки различна подготовка на проби и анализ на MS платформа. Z-резултатните графики на експресията на тези крайни панели в CSF копие 1 контрола и случаи на AD потвърждават тенденцията на панела, наблюдавана в кохортата на CSF, която открихме (Фигура 5B).
Сред тези 60 протеина има молекули, за които е известно, че са свързани с AD, като остеопонтин (SPP1), който е провъзпалителен цитокин, който е свързан с AD в много проучвания (39-41), и GAP43, синаптичен протеин което е ясно свързано с невродегенерация (42). Най-пълно проверените протеини са маркери, свързани с други невродегенеративни заболявания, като супероксид дисмутаза 1 (SOD1), свързана с амиотрофична латерална склероза (ALS), и дезахараза, свързана с болестта на Паркинсон (PARK7). Ние също така проверихме, че много други маркери, като SMOC1 и богат на мозъка мембранен сигнализиращ протеин 1 (BASP1), са ограничили предишни връзки с невродегенерация. Струва си да се отбележи, че поради ниското им общо изобилие в CSF протеома, за нас е трудно да използваме този високопроизводителен метод за еднократно откриване за надеждно откриване на MAPT и някои други протеини, свързани с AD (например NEFL и NRGN ) (43, 44).
След това проверихме тези 60 приоритетни панелни маркера в три допълнителни репликативни анализа. В CSF Copy 2 използвахме единична TMT-MS, за да анализираме независима група от 297 контролни и AD проби от Emory Goizueta ADRC (17). CSF репликация 3 включва повторен анализ на наличните TMT-MS данни от 120 контролни пациенти и пациенти с AD от Лозана, Швейцария (45). Открихме повече от две трети от 60-те приоритетни маркера във всеки набор от данни. Въпреки че швейцарското проучване използва различни платформи на MS и методи за количествено определяне на TMT (45, 46), ние силно възпроизведохме нашите панелни тенденции в два повторени анализа (Фигура 5, C и D и таблици S2, I и J). За да оценим специфичността на заболяването на нашата група, използвахме TMT-MS, за да анализираме четвъртия набор от данни за репликация (репликация на CSF 4), който включва не само контролни (n = 18) и AD (n = 17) случаи, но също и PD ( n = 14)), проби от ALS (n = 18) и фронтотемпорална деменция (FTD) (n = 11) (Таблица S1A). Успешно количествено определихме почти две трети от панелните протеини в тази кохорта (38 от 60). Тези резултати подчертават специфичните за AD промени във всичките пет панела на биомаркери (Фигура 5E и Таблица S2K). Увеличаването на метаболитната група показва най-силната AD специфичност, следвана от миелинизацията и глиалната група. В по-малка степен FTD също показва увеличение между тези панели, което може да отразява подобни потенциални промени в мрежата (17). За разлика от това, ALS и PD показват почти същите профили на миелинизация, глия и метаболом като контролната група. Като цяло, въпреки разликите в подготовката на пробите, MS платформата и методите за количествено определяне на TMT, тези повтарящи се анализи показват, че нашите приоритетни панелни маркери имат силно последователни AD-специфични промени в повече от 500 уникални CSF проби.
Невродегенерацията на AD е широко призната няколко години преди появата на когнитивните симптоми, така че има спешна нужда от биомаркери на AsymAD (5, 31). Въпреки това, все повече и повече доказателства показват, че биологията на AsymAD далеч не е хомогенна и сложното взаимодействие на риска и устойчивостта води до големи индивидуални различия в последващото прогресиране на заболяването (47). Въпреки че се използват за идентифициране на случаи на AsymAD, нивата на основните биомаркери на CSF (Aβ1-42, общ тау и p-tau) не са доказали, че могат надеждно да предскажат кой ще прогресира до деменция (4, 7), което показва, че може да бъде необходимо е да се включат холистични инструменти за биомаркери, базирани на множество аспекти на мозъчната физиология, за точно стратифициране на риска от тази популация. Поради това впоследствие анализирахме нашия AD-валидиран панел с биомаркери в AsymAD популацията на CSF копие 1. Тези 31 случая на AsymAD показаха абнормни основни нива на биомаркери (Aβ1–42/общо съотношение tau ELISA, <5,5) и пълна когнитивност (среден MoCA, 27,1 ± 2.2) (Таблица S1A). В допълнение, всички индивиди с AsymAD имат резултат от клинична деменция 0, което показва, че няма доказателства за спад в ежедневните когнитивни или функционални резултати.
Първо анализирахме нивата на валидираните панели във всички 96 реплики на CSF 1, включително кохортата AsymAD. Открихме, че няколко панела в групата AsymAD имат значителни промени в изобилието, подобни на AD, съдовият панел показва низходяща тенденция в AsymAD, докато всички други панели показват възходяща тенденция (Фигура 6А). Следователно, всички панели показват силно значима корелация с ELISA Aβ1-42 и общите нива на тау (Фигура 6В). За разлика от това, корелацията между групата и оценката на MoCA е относително лоша. Едно от по-удивителните открития от тези анализи е големият диапазон от изобилие на панели в кохортата AsymAD. Както е показано на фигура 6A, нивото на панела на групата AsymAD обикновено пресича нивото на панела на контролната група и групата AD, показвайки относително висока променливост. За по-нататъшно изследване на тази хетерогенност на AsymAD, ние приложихме анализ на многомерно мащабиране (MDS) към 96 случая на репликация 1 на CSF. MDS анализът позволява да се визуализира приликата между случаите въз основа на определени променливи в набора от данни. За този клъстерен анализ ние използваме само тези валидирани панелни маркери, които имат статистически значима промяна (P <0,05, AD/контрола) в ниво на откриване на CSF и репликация 1 (n = 29) (Таблица S2L). Този анализ доведе до ясно пространствено групиране между нашите контролни и AD случаи (Фигура 6C). За разлика от това, някои случаи на AsymAD са ясно групирани в контролната група, докато други са разположени в случаи на AD. За да проучим по-нататък тази хетерогенност на AsymAD, използвахме нашата MDS карта, за да дефинираме две групи от тези случаи на AsymAD. Първата група включва случаи на AsymAD, групирани по-близо до контролата (n = 19), докато втората група се характеризира със случаи на AsymAD с маркерен профил, по-близък до AD (n = 12).
(A) Нивото на експресия (z-резултат) на групата биомаркери на CSF във всичките 96 проби в кохортата на репликация 1 на CSF, включително AsymAD. Анализът на дисперсията с последващата корекция на Tukey беше използван за оценка на статистическата значимост на промените в изобилието на панела. (B) Корелационен анализ на ниво на изобилие на панелен протеин (z-резултат) с MoCA резултат и общо ниво на tau в проби ELISA Aβ1-42 и CSF копие 1. Показва се корелационният коефициент на Pearson със съответната P стойност. (C) MDS на 96 случая на CSF копие 1 се основава на нивата на изобилие на 29 валидирани панелни маркера, които са значително променени както в наборите от данни за откриване, така и в CSF копие 1 [P <0,05 AD/контрола (CT)]. Този анализ беше използван за разделяне на групата AsymAD на контролни (n = 19) и AD (n = 12) подгрупи. (D) Графиката на вулкана показва диференциалната експресия на всички протеини на CSF репликация 1 с log2 пъти промяна (ос x) спрямо -log10 статистическата P стойност между двете AsymAD подгрупи. Панелните биомаркери са оцветени. (E) Нивото на изобилие на CSF репликация 1 на биомаркерите на селекционната група се експресират по различен начин между подгрупите на AsymAD. Пост-коригираният дисперсионен анализ на Tukey беше използван за оценка на статистическата значимост.
Изследвахме диференциалната протеинова експресия между тези контролни и подобни на AD случаи на AsymAD (Фигура 6D и Таблица S2L). Получената карта на вулкана показва, че 14 панелни маркера са се променили значително между двете групи. Повечето от тези маркери са членове на синапса и метаболома. Въпреки това, SOD1 и богатият на миристоилиран аланин протеин киназа С субстрат (MARCKS), които са членове съответно на миелиновите и глиалните имунни групи, също принадлежат към тази група (Фигура 6, D и E). Съдовият панел също допринесе за два маркера, които бяха значително намалени в AD-подобната AsymAD група, включително AE свързващ протеин 1 (AEBP1) и член на семейството на комплемента C9. Няма значителна разлика между контролната и AD-подобната AsymAD подгрупи в ELISA AB1-42 (P = 0,38) и p-tau (P = 0,28), но наистина има значителна разлика в общото ниво на tau (P = 0,0031 ) (Фиг. S7). Има няколко панелни маркера, които показват, че промените между двете подгрупи на AsymAD са по-значими от общите нива на тау (например YWHAZ, SOD1 и MDH1) (Фигура 6E). Като цяло, тези резултати показват, че нашият валидиран панел може да съдържа биомаркери, които могат да подтипират и да определят потенциалната рискова стратификация на пациенти с асимптоматично заболяване.
Съществува спешна нужда от системни биомаркерни инструменти за по-добро измерване и насочване към различните патофизиологии зад AD. Очаква се тези инструменти не само да променят нашата диагностична рамка за AD, но и да насърчат приемането на ефективни, специфични за пациента стратегии за лечение (1, 2). За тази цел ние приложихме безпристрастен всеобхватен протеомичен подход към AD мозъка и CSF, за да идентифицираме уеб базирани CSF биомаркери, които отразяват широк спектър от мозъчна патофизиология. Нашият анализ създаде пет панела биомаркери на CSF, които (i) отразяват синапси, кръвоносни съдове, миелин, имунна и метаболитна дисфункция; (ii) демонстрира силна възпроизводимост на различни MS платформи; (iii) Показване на прогресивни специфични за заболяването промени в ранните и късните стадии на AD. Като цяло, тези открития представляват обещаваща стъпка към разработването на разнообразни, надеждни, уеб-ориентирани биомаркерни инструменти за изследвания на AD и клинични приложения.
Нашите резултати демонстрират силно запазената организация на протеома на мозъчната мрежа на AD и подкрепят използването му като котва за системно базирано развитие на биомаркери. Нашият анализ показва, че два независими набора от данни TMT-MS, съдържащи AD и AsymAD мозъци, имат силна модулност. Тези открития разширяват предишната ни работа, демонстрирайки запазването на мощните модули на повече от 2000 мозъчни тъкани от множество независими кохорти във фронталния, париеталния и темпоралния кортекс (17). Тази консенсусна мрежа отразява различни промени, свързани със заболяването, наблюдавани в настоящите изследвания, включително увеличаването на богатите на глии възпалителни модули и намаляването на богатите на неврони модули. Подобно на настоящите изследвания, тази широкомащабна мрежа също включва значителни модулни промени в AsymAD, показващи разнообразие от различна предклинична патофизиология (17).
Въпреки това, в рамките на тази силно консервативна система, базирана на рамка, има по-фина биологична хетерогенност, особено сред индивидите в ранните етапи на AD. Нашият панел с биомаркери е в състояние да изобрази две подгрупи в AsymAD, които демонстрират значителната диференциална експресия на множество CSF маркери. Нашата група успя да подчертае биологичните разлики между тези две подгрупи, които не бяха очевидни на нивото на основните AD биомаркери. В сравнение с контролната група съотношенията Aβ1-42/общ тау на тези индивиди на AsymAD са необичайно ниски. Въпреки това, само общите нива на тау са значително различни между двете подгрупи на AsymAD, докато нивата на Aβ1-42 и p-tau остават относително сравними. Тъй като високото CSF тау изглежда е по-добър предиктор на когнитивните симптоми от нивата на Aβ1-42 (7), ние подозираме, че двете кохорти на AsymAD могат да имат различни рискове от прогресия на заболяването. Като се има предвид ограниченият размер на извадката от нашия AsymAD и липсата на надлъжни данни, са необходими допълнителни изследвания, за да се направят уверени тези заключения. Въпреки това, тези резултати показват, че системно базиран панел на CSF може да подобри нашата способност за ефективно стратифициране на индивидите по време на асимптоматичния стадий на заболяването.
Като цяло, нашите открития подкрепят ролята на множество биологични функции в патогенезата на AD. Въпреки това нерегулираният енергиен метаболизъм се превърна в основна тема на всичките ни пет валидирани панела за етикетиране. Метаболитни протеини, като хипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза 1 (HPRT1) и лактат дехидрогеназа А (LDHA), са най-стабилно валидираните синаптични биомаркери, което показва, че увеличението на AD CSF е силно възпроизводим пол. Нашите кръвоносни съдове и глиални панели също съдържат няколко маркера, участващи в метаболизма на окислителните вещества. Тези констатации са в съответствие с ключовата роля, която метаболитните процеси играят в целия мозък, не само за посрещане на високото енергийно търсене на невроните, но и за посрещане на високото енергийно търсене на астроцити и други глиални клетки (17, 48). Нашите резултати подкрепят нарастващите доказателства, че промените в редокс потенциала и прекъсването на енергийните пътища може да са основната връзка между няколко ключови процеса, включени в патогенезата на AD, включително митохондриални нарушения, глиално-медиирано възпаление и съдово увреждане (49). В допълнение, метаболитните биомаркери на цереброспиналната течност съдържат голям брой диференциално богати протеини между нашите контролни и AD-подобни AsymAD подгрупи, което предполага, че прекъсването на тези енергийни и редокс пътища може да бъде критично в предклиничния стадий на заболяването.
Различните тенденции в панелите на мозъка и цереброспиналната течност, които наблюдавахме, също имат интересни биологични последици. Синапсите и метаболомите, богати на неврони, показват понижени нива в мозъка на AD и повишено изобилие в цереброспиналната течност. Като се има предвид, че невроните са богати на произвеждащи енергия митохондрии в синапсите, за да осигурят енергия за техните многобройни специализирани сигнали (50), се очаква сходството на профилите на експресия на тези две невронни групи. Загубата на неврони и екструзията на увредени клетки могат да обяснят тези тенденции в панела на мозъка и CSF при по-късно заболяване, но не могат да обяснят ранните промени в панела, които наблюдаваме (13). Едно възможно обяснение за тези находки при ранно асимптоматично заболяване е анормалното синаптично подрязване. Нови доказателства в миши модели предполагат, че медиираната от микроглия синаптична фагоцитоза може да бъде необичайно активирана при AD и да доведе до ранна загуба на синапс в мозъка (51). Този изхвърлен синаптичен материал може да се натрупа в CSF, поради което наблюдаваме увеличение на CSF в невронния панел. Имунно-медиираното синаптично подрязване може също частично да обясни увеличението на глиалните протеини, които наблюдаваме в мозъка и цереброспиналната течност по време на болестния процес. В допълнение към синаптичното подрязване, общите аномалии в екзоцитния път могат също да доведат до различни мозъчни и CSF експресии на невронни маркери. Редица проучвания показват, че съдържанието на екзозоми в патогенезата на мозъка на AD се е променило (52). Извънклетъчният път също участва в пролиферацията на Ар (53, 54). Струва си да се отбележи, че потискането на екзозомалната секреция може да намали AD-подобната патология в AD трансгенни миши модели (55).
В същото време протеинът в съдовия панел показва умерено увеличение в AD мозъка, но значително намалява в CSF. Дисфункцията на кръвно-мозъчната бариера (BBB) може частично да обясни тези открития. Много независими следсмъртни проучвания при хора са показали разпадане на BBB при AD (56, 57). Тези проучвания потвърждават различни анормални дейности около този плътно затворен слой от ендотелни клетки, включително мозъчно капилярно изтичане и периваскуларно натрупване на кръвни протеини (57). Това може да даде просто обяснение за повишените съдови протеини в мозъка, но не може напълно да обясни изчерпването на същите тези протеини в цереброспиналната течност. Една от възможностите е, че централната нервна система активно изолира тези молекули, за да реши проблема с повишеното възпаление и оксидативния стрес. Намаляването на някои от най-тежките CSF протеини в този панел, особено тези, които участват в регулирането на липопротеините, е свързано с инхибирането на вредните нива на възпаление и невропротективния процес на реактивните кислородни видове. Това важи за Paroxonase 1 (PON1), липопротеин-свързващ ензим, отговорен за намаляване на нивата на оксидативен стрес в кръвообращението (58, 59). Прекурсорът на алфа-1-микроглобулин/бикунин (AMBP) е друг значително понижено регулиран маркер на васкуларната група. Той е предшественик на липидния транспортер бикунин, който също участва в потискането на възпалението и неврологичната защита (60, 61).
Въпреки различни интересни хипотези, невъзможността за директно откриване на биохимични механизми на заболяването е добре известно ограничение на протеомичния анализ, основан на откритията. Следователно са необходими допълнителни изследвания, за да се дефинират уверено механизмите зад тези панели с биомаркери. За да се премине към развитието на клиничен анализ, базиран на МС, бъдещата посока изисква също използването на целеви количествени методи за широкомащабна проверка на биомаркери, като селективно или паралелно наблюдение на реакцията (62). Наскоро използвахме мониторинг на паралелни реакции (63), за да потвърдим много от описаните тук промени в CSF протеина. Няколко приоритетни панелни цели се определят количествено със значителна точност, включително YWHAZ, ALDOA и SMOC1, които съпоставят съответно нашите панели за синапс, метаболизъм и възпаление (63). Независимо събиране на данни (DIA) и други базирани на MS стратегии също могат да бъдат полезни за проверка на целта. Bud et al. (64) Наскоро беше демонстрирано, че има значително припокриване между биомаркерите на AD, идентифицирани в нашия набор от данни за откриване на CSF и независимия набор от данни DIA-MS, който се състои от близо 200 проби от CSF от три различни европейски кохорти. Тези скорошни проучвания подкрепят потенциала на нашите панели да се трансформират в надеждно базирано на MS откриване. Традиционното откриване на базата на антитела и аптамер също е важно за по-нататъшното развитие на ключови биомаркери на AD. Поради ниското изобилие на CSF е по-трудно да се открият тези биомаркери с помощта на високопроизводителни MS методи. NEFL и NRGN са два такива примера за биомаркери за CSF с ниско съдържание, които са картографирани в панела в нашия изчерпателен анализ, но не могат да бъдат надеждно открити с помощта на нашата единствена MS стратегия. Стратегиите за насочване, базирани на множество антитела, като PEA, могат да насърчат клиничната трансформация на тези маркери.
Като цяло, това проучване предоставя уникален протеомичен подход за идентифициране и проверка на CSF AD биомаркери, базирани на различни системи. Оптимизирането на тези панели с маркери в допълнителни AD кохорти и MS платформи може да се окаже обещаващо за напредък в стратификацията и лечението на риска от AD. Проучванията, които оценяват надлъжното ниво на тези панели във времето, също са от решаващо значение, за да се определи коя комбинация от маркери най-добре стратифицира риска от ранно заболяване и промени в тежестта на заболяването.
С изключение на 3-те проби, копирани от CSF, всички проби от CSF, използвани в това проучване, са събрани под егидата на Emory ADRC или тясно свързани изследователски институции. Общо четири комплекта проби от CSF на Emory бяха използвани в тези протеомични изследвания. Установено е, че групата CSF съдържа проби от 20 здрави контроли и 20 пациенти с AD. CSF копие 1 включва проби от 32 здрави контроли, 31 AsymAD индивида и 33 AD индивида. CSF копие 2 съдържа 147 контроли и 150 AD проби. Кохортата 4 за репликация на CSF с множество заболявания включва 18 контроли, 17 AD, 19 ALS, 13 PD и 11 FTD проби. Съгласно споразумението, одобрено от Съвета за институционален преглед на университета Емори, всички участници в проучването на Емори са получили информирано съгласие. Според насоките за най-добри практики на Националния институт за стареене за центрове за Алцхаймер от 2014 г. (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), цереброспиналната течност е събрана и съхранена чрез лумбална пункция. Контролните пациенти и пациентите с AsymAD и AD са получили стандартизирана когнитивна оценка в Emory Cognitive Neurology Clinic или Goizueta ADRC. Техните проби от цереброспинална течност бяха тествани с INNO-BIA AlzBio3 Luminex за ELISA Aβ1-42, общ тау и p-tau анализ (65). Стойностите на ELISA се използват в подкрепа на диагностичната класификация на субектите въз основа на установени гранични критерии за AD биомаркери (66, 67). Основни демографски и диагностични данни за други диагнози на CSF (FTD, ALS и PD) също се получават от Emory ADRC или свързани изследователски институции. Метаданните за обобщените случаи за тези случаи на CSF на Emory могат да бъдат намерени в таблица S1A. Характеристиките на швейцарската група репликация 3 на CSF са публикувани преди това (45).
CSF намери пробата. За да се увеличи дълбочината на нашето откритие на набора от данни за CSF, беше извършена имунна консумация на протеини с високо изобилие преди трипсинизация. Накратко, 130 μl CSF от 40 отделни CSF проби и равен обем (130 μl) смола за изчерпване на протеини High Select Top14 Abundance (Thermo Fisher Scientific, A36372) бяха поставени в въртяща се колона (Thermo Fisher Scientific, A89868) на стайна температура Инкубирайте). След центрофугиране за 15 минути, центрофугирайте пробата при 1000 g за 2 минути. 3K ултрацентрофужно филтърно устройство (Millipore, UFC500396) се използва за концентриране на пробата от отпадъчните води чрез центрофугиране при 14 000 g за 30 минути. Разредете всички обеми на пробата до 75 μl с фосфатно буфериран физиологичен разтвор. Концентрацията на протеин се оценява по метода на бицинхониновата киселина (BCA) съгласно протокола на производителя (Thermo Fisher Scientific). Имуноизчерпаният CSF (60 μl) от всичките 40 проби се усвоява с лизил ендопептидаза (LysC) и трипсин. Накратко, пробата се редуцира и алкилира с 1,2 μl 0,5 М трис-2(-карбоксиетил)-фосфин и 3 μl 0,8 М хлороацетамид при 90°C за 10 минути и след това се обработва с ултразвук във водна баня за 15 минути. Пробата се разрежда с 193 μl 8 М урея буфер [8 М урея и 100 тМ NaHPO4 (рН 8,5)] до крайна концентрация от 6 М урея. LysC (4,5 μg; Wako) се използва за смилане през нощта при стайна температура. След това пробата се разрежда до 1 М урея с 50 mM амониев бикарбонат (ABC) (68). Добавете равно количество (4,5 μg) трипсин (Promega) и след това инкубирайте пробата за 12 часа. Подкиселете разградения пептиден разтвор до крайна концентрация от 1% мравчена киселина (FA) и 0,1% трифлуорооцетна киселина (TFA) (66) и след това обезсолете с колона 50 mg Sep-Pak C18 (Waters), както е описано по-горе (25) . След това пептидът се елуира в 1 ml 50% ацетонитрил (ACN). За стандартизиране на количественото определяне на протеини в партиди (25), 100 μl аликвоти от всичките 40 CSF проби бяха комбинирани, за да се генерира смесена проба, която след това беше разделена на пет глобални вътрешни стандартни (GIS) (48) проби. Всички индивидуални проби и комбинирани стандарти се изсушават чрез високоскоростен вакуум (Labconco).
CSF копира пробата. Dayon и колегите му по-рано са описали изчерпване на имунната система и смилане на CSF копие 3 проби (45, 46). Останалите репликирани проби не са индивидуално имунодефицитни. Смилайте тези неотстранени проби в трипсин, както е описано по-горе (17). За всеки повторен анализ, 120 μl аликвотни части от елуирания пептид от всяка проба бяха събрани заедно и разделени на равни обемни аликвотни части, за да бъдат използвани като ТМТ-белязан глобален вътрешен стандарт (48). Всички индивидуални проби и комбинирани стандарти се изсушават чрез високоскоростен вакуум (Labconco). За да се подобри сигнала на CSF протеина с ниско съдържание, чрез комбиниране на 125 μl от всяка проба, се приготвя „подобрена“ проба за всеки повторен анализ [т.е. биологична проба, която имитира пробата за изследване, но наличното количество е много по-голям (37, 69)], слят в смесена CSF проба (17). След това смесената проба беше имуноотстранена с помощта на 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), усвоена, както е описано по-горе, и включена в последващото многократно ТМТ маркиране.
Време на публикуване: 27 август 2021 г